Бактериоскопическое исследование окрашенного мазка ( по Граму)

Где проводится: Во всех медицинских центрах и лабораториях «Тонус»

Клеточная стенка

Рис. 1.3. Схематическое изображение однослойной структуры пептидогликанаРис. 1.4. Детальное строение структуры пептидогликана Светлые и черные короткие стрелки указывают связи, расщепляемые соответственно лизоцимом (мурамидазой) и специфической муроэндопептидазой

Рис. 1.5. Схематическое изображение клеточной стенки у грамположительных (а) и грамотрицательных (б) прокариот: 1 — цитоплазматическая мембрана; 2 — пептидогликан; 3 — периплазматическое пространство; 4 — наружная мембрана; 5 — ДНКТаблица 1.1. Химический состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных прокариот

Микробиология. Окраска по Граму: красители, проведение, результаты

В микробиологии окраска по Граму имеет большое значение. Ее применяют для диагностики инфекционных заболеваний, выявления патогенности бактерий. Метод позволяет определить сходные по форме и размеру бактерии, которые относятся к различным видам и родам.

Особенности окраски

Окраска бактерий по Граму – сложный метод, в котором применяют два вида окраса: основной и дополнительный. В процессе выполнения манипуляции применяют обесцвечивающие вещества, к которым относятся спирты и кислоты.

Какая у вас степень владения языком?

В микробиологии окраску по Граму проводят трифенилметановой группой красителей. К ней относятся генциановые, метиловый синий, кристаллвиолет. Разные виды бактерий дают разные окрасы, образуя прочные соединения с красителями.

Окрасы

В микробиологии окраска по Граму бывает двух видов: грамположительная и грамотрицательная. В первом случае микроорганизмы дают прочные соединения с красителями и йодом. Во время анализа они не обесцвечиваются при воздействии со спиртом, из-за чего не изменяют своего первоначального фиолетового оттенка.

Грамотрицательные окрасы образуются при воздействии с йодом и легко разрушаются под действием йода. В результате микробы обесцвечиваются, а затем приобретают красный оттенок.

Подготовка материала

По правилам микробиологии, окраска по Граму требует предварительной подготовки материалов. Его необходимо распределить тонким слоем по поверхности стекла. Затем мазок подсушивают и после полного высыхания фиксируют. При этом мазок закрепляется на стекле, что позволяет исключить смывание бактерий красителями. К тому же мертвые микроорганизмы окрашиваются лучше, чем живые.

После подготовки материала подбирают метод окрашивания: физический или химический. Первый предполагает воздействие высокой температуры на микробную клетку. Во время химического способа применяют различные химические вещества, которые вызывают коагуляцию протеинов цитоплазмы.

Подготавливают набор для окраски по Граму, предметные стекла с бактериями. Их берут пинцетом или аккуратно пальцами за ребра мазком вверх, затем проводят пару раз над верхом пламени горелки. Процесс должен занимать пару секунд.

Процесс фиксации химическим методом предполагает использование ацетона, спирта, специальных смесей, жидкость Карнуа. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в фиксирующее вещество на пятнадцать минут, затем просушивают на воздухе.

Окрашивание

Окраска мазков по Граму проводится по определенному алгоритму.

  • Сначала на фиксированный мазок наносят основной краситель на пару минут. Во избежание появления осадка процедуру выполняют с использованием фильтровальной бумаги.
  • Микробиология. Окраска по Граму: красители, проведение, результаты
  • Краситель удаляется (сливается), убирается бумага. Мазок погружается в раствор Люголя на две минуты или в йодистый раствор по Граму до почернения препарата.
  • Мазок поласкают спиртовым раствором или ацетоном, наливая и сливая его до тех пор, пока и мазок не обесцветится, и жидкость не станет чистой. Это занимает примерно от 30 до 60 секунд.
  • Стекла тщательно промывают дистиллированной водой.
  • Чтобы определить, есть ли в мазке грамотрицательные бактерии, проводят дополнительно окрашивание фуксином или сафранином. Препараты наносят на две минуты. В конце процедуры стекло промывают, высушивают.

    Результаты

    Все грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в красный. Шарообразные формы обычно относятся к грамположительным видам, а извитые формы – отрицательно окрашиваются. Палочковидные бактерии могут быть грамотрицательными и грамположительными.

    Чтобы получить максимально достоверные результаты исследований, рекомендуется применять суточные культуры, а также свежеприготовленные растворы для окрашивания.

    Механизм окраски позволяет увидеть и оценить физико-химические особенности строения цитоплазмы, клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

    У первых содержится много рибонуклеиновой кислоты, белков в цитоплазме, а в клеточных стенках – пептидогликана.

    Из-за этого во время обработки мазков генцианвиолетом и Люголем у грамположительных видов бактерий образуется прочное соединение ионов йода и красителя.

    При обработке спиртами грамположительные микроорганизмы удерживают краситель, а грамотрицательные – обесцвечиваются и окрашиваются дополнительно разведенным фуксином в красный оттенок. Некоторые бактерии способны окрашиваться только на стадии роста.

    Читайте также:  Остеомиелит у взрослых и детей: симптомы и лечение костей

    Применение

    Окраску по Граму проводят при анализе вида микроорганизмов в мазках из влагалища и слюны. Этот способ позволяет определить вид микроорганизмов в кале, в плевральной, перитонеальной жидкости и не только.

    Любые жидкости, где могут содержаться бактерии, исследуют данным методом.

    После проведения окрашивания врачи подбирают метод лечения, назначая препараты, способные воздействовать на грамположительные или грамотрицательные бактерии.

    Источник

    Микобактерии туберкулеза

    Микобактерии* туберкулеза

    Возбудителями туберкулеза у человека являются М. tuberculosis (более 90% всех случаев туберкулезной инфекции, М. bovis (5%) и М. africanum (около 3%, главным образом среди населения стран тропической Африки). М. tuberculosis открыт Р. Кохом в 1882 г.

    Морфология и физиология. Микобактерии туберкулеза – грамположительные прямые или слегка изогнутые палочки. В состав микобактерии входят липиды (10-40%), миколовая, фтионовая, туберкулостеариновая и другие жирные кислоты.

    Структурный скелет клеточной стенки микобактерии представляет собой два ковалентно связанных полимера – миколат арабиногалактазана и пептидогликан, к которому присоединены белки, полисахариды, липиды.

    Такой сложный химический комплекс с высоким содержанием липидов придает клеткам микобактерии туберкулеза ряд характерных свойств: устойчивость к кислотам, щелочам и спирту, а также гидрофобность. Для окраски туберкулезных палочек применяют метод Циля-Нильсена.

    В культурах встречаются зернистые формы, ветвящиеся, зерна Муха – шаровидные кислотоподатливые, легко окрашивающиеся по Граму. Возможен переход в фильтрующиеся и L-формы. Неподвижны, спор и капсул не образуют.

    Для культивирования туберкулезных микобактерии в лабораторных условиях используют специальные питательные среды, содержащие яйца, глицерин, картофель, аспарагин, витамины, соли. Чаще всего применяют яичную среду Левенштейна-Йенсена и синтетическую среду Сотона. Размножаются микобактерии туберкулеза медленно.

    В оптимальных условиях время генерации составляет около 15 ч, тогда как бактерии многих других родов делятся через каждые 20-30 мин. Рост туберкулезных микобактерии можно обнаружить через 2-3 недели и позднее- до 2-3 мес, особенно в первых генерациях. На плотных средах образуются морщинистые, сухие колонии с неровными краями; в жидких средах на поверхности образуется нежная пленка, которая утолщается и падает на дно, среда при этом остается прозрачной. Для получения более гомогенного роста микобактерии к питательным средам добавляют твин – 80 (поверхностно-активное вещество).

    Антигены микобактерии содержат протеины, полисахариды, липиды, фосфатиды. Антитела к ним определяются в РСК, РНГА, преципитации в геле. Имеются общие и специфические антигены у М. tuberculosis, M. bovis и других микобактерии, включая сапрофитические виды.

    Патогенность туберкулезных микобактерии связана с прямым или иммунологически опосредованным повреждающим действием липидов (воском Д, мураминдипептидом, фтионовыми кислотами), а также туберкулином.

    Микобактерии туберкулеза

    Их действие выражается в развитии специфических гранулем и поражении тканей. Для вирулентных штаммов характерно наличие так называемого кордфактора – гликолипида, состоящего из трегалозы и димиколата.

    Он разрушает митохондрии клеток инфицированного организма, тем самым нарушая функцию дыхания. Микобактерии не образуют экзотоксин.

    Патогенез. В зоне проникновения и размножения микобактерии возникает специфический воспалительный очаг – инфекционная гранулема (первичный эффект). Затем развивается специфический воспалительный процесс в региональных лимфатических узлах и наблюдается сенсибилизация организма. Таким образом, формируется так называемый первичный туберкулезный комплекс.

    В подавляющем большинстве случаев первичный очаг имеет доброкачественное течение. Он рассасывается, пораженный участок кальцинируется и рубцуется. Однако этот процесс не завершается полным освобождением организма от возбудителя. В первичном очаге и лимфатических узлах туберкулезные бактерии могут сохраняться многие годы, иногда в течение всей жизни.

    Такие люди, оставаясь инфицированными, приобретают иммунитет к туберкулезу. При неблагоприятных заболеваниях, особенно на фоне плохих социальных факторов (недостаточное и неполноценное питание, неудовлетворительные жилищные условия, сопутствующие заболевания) может наступить активация возбудителя и генерализация процесса. Наиболее часто встречается туберкулез легких.

    Генерализация инфекции приводит к развитию внелегочных форм туберкулеза: кожи, костей и суставов, почек и других органов. Локализация процесса в определенной степени зависит от путей проникновения микобактерии в организм человека и вида возбудителя. Патогенетически важным является действие на организм инфицированного человека туберкулина. Впервые это вещество получил Р.

    Кох в 1890 г., а изученный им препарат был назван «старый туберкулин». Очищенный от примесей туберкулин (PPD – очищенный протеиновый дериват) является белком. Внутрикожное введение туберкулина вызывает у инфицированных микобактериями людей местную воспалительную реакцию в виде инфильтрата и покраснения (реакция Манту).

    Неинфицированные люди никакой реакции на введение туберкулина не дают. Эту пробу применяют для выявления инфицированных, сенсибилизированных людей.

    М. tuberculosis

    Микроскопия нативного мазка, окраска по Граму

    Метод Грама представляет собой метод окрашивания микроорганизмов для исследования, что позволяет дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенке. Данное исследование было разработано в 1884 году датским врачом Гансом Кристианом Грамом.

    Для окрашивания мазка по Граму применяется анилиновый краситель — генциановый или метиловый фиолетовый и другие, после чего краситель фиксируют раствором йода.

    Читайте также:  Лекарства, повышающие иммунитет — поддержите свой организм

    При промывании окрашенного препарата спиртом виды бактерий, которые оказались прочно окрашенными в синий цвет, называют грамположительными бактериями, они обозначаются Грам (+), — в отличие от грамотрицательных, Грам (−), которые при промывке обесцвечиваются.

    После промывания растворителем при окрашивании по Граму добавляется контрастный красный краситель, окрашивающий все грамотрицательные бактерии в красный либо розовый цвет.

    Данная особенность основана на наличии у бактерии внешней мембраны, которая не позволяет проникнуть красителю внутрь клетки.

    Анализ применяется для классификации бактерий, разделяя их на две группы, основываясь на строении их клеточной стенки.

    Окраска по Граму имеет важное значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

    Кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжи — грамположительны и при окрашивании приобретают иссиня-черный или темно-синий цвет, многие неспороносные бактерии — грамотрицательны и окрашиваются в красный цвет, при этом ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, а цитоплазма — розовый.

    Окраска по Граму – это достаточно сложный способ окраски, так как в этом случае на мазок воздействуют двумя красителями, один из которых является основным, а другой — дополнительным. Помимо красящих веществ при сложных способах окраски используются обесцвечивающие вещества, например, спирт или кислоты.

    При проведении окраски по Граму преимущественно применяются красители трифенилметановой группы, такие как генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллический фиолетовый.

    Грамположительные Грам (+) микроорганизмы формируют прочное соединение с перечисленными выше красителями и йодом.

    При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, в результате чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

    Грамотрицательные Грам (-) микроорганизмы формируют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под воздействием спирта соединение, вследствие этого происходит обесцвечивание микробов, благодаря чему они окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

    Показания

    Данное исследование назначается:

    при заболеваниях мочеполовых органов, например, цистите, уретрите, пиелонефрите, простатите для обнаружения их возбудителя;

    при заболеваниях ЛОР-органов, например, отите, синусите, рините, ангине, тонзиллите;

    при заболеваниях бронхолегочной системы, таких как трахеит, бронхит, плеврит, воспалительное поражение легких;

    при заболеваниях пищеварительного тракта инфекционного генеза, гастритах, энтеритах, а также острых кишечных инфекциях.

    Полученные результаты

    Метод Грама позволяет дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки.

    Окраска по Граму имеет важное значение в систематике бактерий, не менее важной она является для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

    Грамположительны кокковые (кроме представителей рода Neisseria) и спороносные (за исключением Coxiella burnetii) формы бактерий окрашиваются в иссиня-черный либо темно-синий цвет.

    Грамотрицательные многие неспороносные бактерии окрашиваются в красный или розовый цвет.

    Предполагаемые болезни

    Результаты микроскопии дают возможность ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видов микроорганизмов в биологическом материале, что также позволяет получить предварительную информацию об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет специалисту быстро назначить корректное лечение (эмпирическое). Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму, применяют при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек, например, мазка из цервикального канала, зева, носа, глаза, уретры, ротоглотки.

    Врач-консультант

    Данное исследование может быть назначено врачом общей практики, оториноларингологом, инфекционистом, хирургом, терапевтом, педиатром.

    Отличия грамположительных и грамотрицательных диплококков

    Грамположительные  и грамотрицательные диплококки легко отличить при лабораторных исследованиях. Первые окрашиваются в фиолетовый цвет при промывании обесцвечивающим раствором. Грамотрицательные бактерии, в отличие от грамположительных не подвижны, не формируют споры.

    Грамотрицательные диплококки обладают более тонким пептидогликановым слоем. Кроме того, в наружной мембране отсутствуют порины, которые функционируют подобно порам.

    У грамположительных бактерий жгутик имеет два поддерживающих кольца, а у грамотрицательных их четыре. Отсутствие защитной оболочки у грамотрицательных диплококков свидетельствует о том, что они не могут быть устойчивы к антибиотикам.

    Отличия грамположительных и грамотрицательных диплококков

    А вот грамположительные бактерии при неправильном выборе препаратов начинают распространяться с большей скоростью.

    Несмотря на то, что грамположительные диплококки сильно отличаются от грамотрицательных, болезни, которые вызывают оба типа бактерий, крайне опасны для человека. При этом заболевания могут протекать бессимптомно и их удается выявить только при плановом осмотре у специалиста. Именно поэтому рекомендуется не менее чем раз в полгода посещать врача.

    ВконтактеFacebookTwitterGoogle+Одноклассники

    Окраска по методу Грама

    1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильт­ровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снять, а краситель слить.

    2. Нанести раствор Люголя на 1—2 мин.

    3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30—60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

    4. Промыть водой.

    5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1—2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

    Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фио­летовый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцве­чивание — удаление комплекса генцианового фиолетового с

    Читайте также: 

    йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс ген-цианового фиолетового с йодом.

    Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спир­том. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.

    Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробио­логии. К грамположительным бактериям относятся стафило­кокки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грам-отрицательным — гонококки, менингококки, кишечная палоч­ка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимос­ти от возраста культуры, особенностей культивирования и дру­гих факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.

    Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Гра­ма, заключается в «переобесцвечивании» мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утра­чивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фук­сином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.

    Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля—Ниль­сена

    1. На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подо­греть 3—5 мин до появления паров.

    2. Снять бумагу, промыть мазок водой.

    3. Нанести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с хлористоводородной кислотой на 1 —2 мин для обесцвечивания.

    4. Промыть водой.

    5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3—5 мин.

    6. Промыть водой, высушить и микроскопировать.

    В основе метода лежат протравливание (разрыхление) кле­точной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кис-лотоустойчивость бактерий обусловлена особым строением их клеточной стенки с повышенным содержанием липидов: раз-

    ветвленных жирных кислот (миколовых кислот), глико- и фос-фолипидов, восков. Клеточная стенка кислотоустойчивых бак­терий имеет очень низкую проницаемость, поэтому они пло­хо воспринимают красители. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинк-ториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодей­ствия красителя с бактериальными клетками, которые при этом окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечива­ются и в дальнейшем окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окра­шенными фуксином в красный цвет (рис. 2.2.2; на вклейке).

    Способы заражения диплококками

    Заражение инфекциями происходит от больного человека. Пути передачи этих патогенных бактерий зависят от их вида:

    1. Внутриклеточные полиморфные и внеклеточные диплококки (гонококки) проникают в организм посредством незащищенного секса, при совместном использовании индивидуальных бытовых предметов личной гигиены (полотенец, зубных щеток), а также внутриутробно.
    2. Менингококковые диплококки передаются от больного человека здоровому, как правило, воздушно-капельным путем. Очаги инфекции находятся на слизистой носоглотки, оболочке головного мозга.
    3. Пневмококки передаются контактно-бытовым, воздушно-капельным путем.

    Грамположительный мир

    Эти микроорганизмы окрашиваются способом Грама в фиолетовый цвет. Смысл процедуры состоит в том, что толщина защитного слоя бактериальной клетки довольно высока, за счет чего краситель удерживается. Грамположительные бактерии представлены стафилококками, стрептококками. Кроме того, грамположительные бактерии – возбудители таких опасных недугов, как газовая гангрена, столбнячная инфекция, сибирская язва. От грамотрицательных бактерий они отличаются по строению и толщине клеточной стенки. Именно она определяет внешний вид микроорганизмов: спиралевидный холерный вибрион, шаровидная кокковая форма. Бактериальная клетка отличается от клеток млекопитающих наличием жесткого защитного каркаса, состоящего из плотного биополимерного слоя, и химическим составом. Этим обусловлена реакция бактерий на действие антибиотиков.

    Грамположительный мир

    Грамположительные бактерии имеют толстый ригидный слой (клеточную стенку). Защитная оболочка состоит из полипептидов и полисахаридов. До 70% стенки составляет муреиновый мешок. В его состав входят: лизин, ацетилглюкозаминин, ацетилмурамовая кислота, диаминопимелиновая и тейхоевые кислоты.

    Применение метода в медицине

    Метод Грама по разделению микроорганизмов на грамположительные и грамотрицательные бактерии способствовал совершенствованию микробиологических исследований. Он помогает выявлять устойчивость патогенных видов к лекарственным препаратам, разрабатывать новые антибиотики для борьбы с ними. Ведь прочная клеточная стенка грамотрицательных бактерий делает их нечувствительными к обычным антибактериальным препаратам. А оболочка грамположительных микроорганизмов, хоть и очень толстая, но проницаема для жидкостей и антибиотиков.